به طور کلی ۴ روش تشخیصی کلی میتواند مطرح باشد:
۱- Nucleic Acid Amplification Tests (NAATs)
۲- Viral Sequencing
۳- Serological testing
۴- Viral culture
در حال حاضر، Nucleic Acid aAmplification Tests بیشترین استفاده را دارند در تشخیص COVID-19. شایع ترین روش مورد استفاده در این گروه real time reverse transcriptase PCR یا همان rRT-PCR می باشد.
باید این نکته را در نظر داشت که SARS-CoV-2 یک RNA ویروس هست. بنابراین نیاز به یک Reverse Transcriptase داریم برای تولید cDNA که بعد بشود با آن PCR انجام داد. به این تکنیک PCR اصطلاحا RT-PCR گفته میشود. ژن های مورد هدف در RT-PCR عبارتند از E، N، S، و RdRp. البته مناطق هدف دیگری از ژنوم ویروس برای تشخیص استفاده میشود مانند ORF1ab و ORF1b-nsp 14.
در ابتدا PCR ها فقط در نقطه انتهای run کردن به ما یک گزارش میدادند (End-point analysis) در مورد پاتوژن. این PCR ها conventional بود. حال اما میتوان در طی نقاط مختلف زمانی run کردن و به صورت زنده Amplification ویروس رو ردیابی کرد. به این روش میگویند real-time PCR.
دستگاه های real-time PCR میتوانند qualitative یا quantitative باشند. در حالت کیفی گزارشی که ما دریافت میکنیم آلوده بودن یا آلوده نبودن نمونه با پاتوژن مورد نظر است. در حال حاضر خیلی از آزمایشگاه های مرکزی که با COVID-19 سر و کار دارند از روش qualitative rRT-PCR استفاده میکنند.
اما اگر به دنبال پیدا کردن load ویروس باشیم از quantitative PCR یا همون qPCR استفاده میکنیم.
توالی یابی با روش Sanger Sequencing برای ژن RNA dependent RNA Polymerase یا همون RdRp برای تشخیص بیماری استفاده میشود. مخصوصا زمانی که نتایج PCR برای یک ژن هدف ما قانع کننده نباشد و شک بالینی/اپیدمیولوژیک برای COVID-19 بالا باشد. توالی یابی کل ژنوم در تشخیص کمتر استفاده میشود ولی برای پیدا کردن شباهت های ژنومیک بین افراد بیمار (molecular epidemiology) و احتمال وجود جهش ها استفاده میشود. مثلا با دستگاه های nanopore MinION.
مشکل روش های مولکولی این است که ممکن است اگر مریض دیرتر از حد خاصی مراجعه کند به مرکز درمانی، نتوان ویروس رو تشخیص داد. و یا نمیتوان به صورت گذشته نگر فهمید چه کسانی مریض هستند (مثلا برای افراد کم علامت یا بی علامت) و یا چه کسانی احیانا ایمن هستند.
اینجاست که روش های سرولوژیک به کار می آیند (مثلا آنتی بادی های IgM و IgG و IgA ضد انتی ژن های ویروسی مثل nucleoprotein و receptor binding domain پروتئین S). در واقع اگر ظن قوی اپیدمیولوژیک به COVID-19 وجود داشته باشد و NAAT منفی باشد، با گرفتن سرم بیمار در فاز حاد و convalescence بیمار میتوان تشخیص را تایید یا رد کرد. البته شاید نقطه ی ضعف روش های سرولوژیک این باشد که نتوان از آنها در ابتدای بیماری افراد استفاده کرد زیرا شاید آنتی بادی ها هنوز تولید نشده باشند. و همچنین ممکن است cross-reaction بین کرونا ویروس های دیگر وجود داشته باشد. تعداد بسیاری زیادی از شرکت ها serologic assays تولید کردند و validate کردن. منتهی هنوز در سطح وسیع این serologic assays مورد استفاده قرار نگرفتند و مورد تایید FDA قرار نگرفتن هنوز.
در حال حاضر کشت ویروسی به عنوان روش تشخیصی متداول برای SARS-CoV-2 توصیه نمی شود. روش کشت بیشتر جنبه ی تحقیقاتی دارند. برای تایید وجود ویروس زنده در سطوح مختلف، میزان واگیردار بودن بیماری بین افراد، و مهار کردن infection سلول های کشت شده در ازمایشگاه توسط درمان های آزمایشی استفاده میشود.
در مورد turn around time یا همان زمان گرفتن جواب ازمایش، در حال حاضر تست های مولکولی در آزمایشگاهی مرکزی بیشتر انجام میشود و بین چند ساعت تا ۲۴ ساعت گرفتن جواب طول میکشد. حال با تعبیه point of care tests که نیازی به انجام در آزمایشگاه ندارند، میتوان زمان دریافت جواب را بسیار کاهش داد. در این راستا، شرکت Cepheid یک point of care test به نام Xpert:registered: Xpress SARS-CoV-2 را درست کرده که در مدت ۴۵ دقیقه جواب ازمایش qualitative rRT-PCR را به شما میدهد (ژن ها و مناطق ژنومیک مورد هدف: E، N، RdRp و ORF1a).
همچنین شرکت Abott یک تست point of care درست کرده به نام ID NOW COVID-19 که جواب مثبت rRT-PCR خود را در ۵ دقیقه و جواب منفی آن را در ۱۳ دقیقه گزارش میدهد (احتمالا qualitative PCR است. ژن هدف: RdRp).
References
۱- Laboratory testing for 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) in suspected human cases. WHO Interim guidance. 19 March 2020. https://www.who.int/publications-detail/laboratory-testing-for-2019-novel-coronavirus-in-suspected-human-cases-20200117
۲- Coronavirus disease (COVID-19) technical guidance: Laboratory testing for 2019-nCoV in humans. WHO. https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/technical-guidance/laboratory-guidance
۳- Public Health Ontario: COVID-19 Testing. https://www.publichealthontario.ca/fr/laboratory-services/test-information-index/wuhan-novel-coronavirus
سلام ادمین گرامی تلگرامتون رو چک نمیکنید؟